文丨邻村胡大爷

编辑丨邻村胡大爷

前言

组学技术的进步现在允许产生高度连续的基因组组装，在单细胞水平上检测转录本和代谢物以及高分辨率确定基因调控特征。使用互补的多组学方法，蔷薇中的单萜吲哚生物碱生物合成途径，这是主要抗癌药物的来源。

在八条玫瑰梭菌染色体上确定了参与单萜吲哚生物碱生物合成的基因簇和单萜吲哚生物碱通路基因的广泛基因复制。聚类不仅限于线性基因组，通过染色质相互作用数据，单萜吲哚生物碱途径基因存在于相同的拓扑相关结构域中，从而允许鉴定转运蛋白。

单细胞RNA测序揭示了叶片单萜吲哚生物碱生物合成途径的顺序细胞类型特异性分配，当与单细胞代谢组学方法结合使用时，允许鉴定产生双吲哚生物碱无水长春碱的还原酶。还揭示了根单萜吲哚生物碱通路中的细胞类型特异性表达。

植物细胞

植物代谢途径的基因发现依赖于全组织衍生数据集发现需要将基因的表达与目标分子的存在相关联。高质量的基因组组装通过允许鉴定生物合成基因簇来进一步促进途径基因发现，但这种簇发生在有限数量的植物途径中。

鉴定复杂代谢途径中的所有基因通常需要对大量候选基因进行功能性筛选;当基因没有核心调节时，这些挖掘方法会进一步受到限制。在植物中，这些复杂的特殊代谢物的生物合成途径不仅局限于不同的器官，而且定位于器官内的不同细胞类型。

单细胞组学的出现具有彻底改变植物代谢途径基因发现的巨大潜力单细胞组学揭示了代谢途径如何在细胞类型之间划分。药用植物物种生产单萜吲哚生物碱，这是一个具有多种化学支架和生物活性的天然产品系列。

单萜吲哚生物碱

玫瑰花中的单萜吲哚生物碱生物合成在器官间显示出不同的代谢物谱，叶片产生长春花碱和长春新碱，在过去的30年中，使用全组织衍生组学数据集的传统生化和共表达分析，已经发现了38个专门的单萜吲哚生物碱通路基因和几种参与单萜吲哚生物碱生物，合成通路茉莉酸诱导的转录因子。

玫瑰梭菌不仅作为抗癌药物的生产商具有巨大的经济重要性，而且还成为探索特殊代谢途径定位、运输和调节的机制基础的模式物种。染色体构象捕获和单细胞转录组学数据集如何支持单萜吲哚生物碱生物合成途径的发现。

38步单萜吲哚生物碱途径在叶片中的三种不同细胞类型中依次表达，并且还显示了玫瑰花根中单萜吲哚生物碱生物合成途径的细胞类型特异性基因表达的差异。使用长距离染色体相互作用图来揭示有助于协调基因表达的单萜吲哚生物碱生物合成基因簇的三维组织。

为了补充基因组和转录组数据集，开发了一种高通量、高分辨率和半定量的玫瑰花叶细胞单细胞代谢组学分析方法。利用这些组学数据，鉴定了一种细胞内转运蛋白和产生无水长春花碱的缺失还原酶。

为了注释基因组，进行了从头重复鉴定，发现25%的基因组是重复的，逆转录元件是最大的一类转座元件。配对末端测序的基因组引导转录本组装从不同组织用于训练从头到头基因查找器并生成原代基因模型。生成了62万个读数，并使用这些数据以及数据来完善我们的基因模型结构。

最终的注释基因集包含347个基因，每个位点平均有三种替代剪接形式，这归因于注释中使用的深度转录本数据。对注释基因模型的分析显示提示通过手动检查和管理已知单萜吲哚生物碱通路基因确认了高质量的注释。

高度连续的v3组装揭示了单萜吲哚生物碱途径基因的簇。鉴定出两个簇，一个包含四氢阿尔斯托宁合酶同源物、杂育亨宾合酶的副源源阵列，以及一个含有蛇纹石合酶，具有几乎相同的蛋白质序列、严格糖苷葡萄糖苷酶和旁系物。

基因重复是化学多样性的主要驱动因素，并且在v207基因组中鉴定出先前与单萜吲哚生物碱生物合成有关的69个基因的3个旁系同源物，其中大量是局部重复的。多药和毒性化合物外排转运蛋白也位于簇中。

基因簇和染色体构象特征

高质量的玫瑰花v3基因组和注释为加速发现，最终的单萜吲哚生物碱生物合成途径基因，以及该通路的复杂器官和细胞类型特异性基因调控机制提供了基础。与在原核基因组中发现的生物合成基因簇不同，植物基因组中的生物合成基因簇具有松散的组织，不相关的基因或长基因间空间将生物合成基因分开。

这些基因簇既促进基因鉴定，又被认为在转录调控中发挥作用。随着最近绘制染色体构象特征的出现，现在有能力探测基因在3D空间中的位置。除了搜索在染色体上线性组织的生物合成基因簇外，还可以搜索限制在同一3D空间内的生物合成基因。

使用基因组组装，使用成熟叶片的数据在3D空间中探测生物合成基因之间的染色质相互作用。吻痕用于检测拓扑相关结构域以检测染色体环，揭示与生物合成基因簇相关的不同染色体组织。

在玫瑰花幼叶中对该基因进行了病毒诱导的基因沉默。尽管赛洛甘素和下游生物碱的水平没有响应沉默而发生实质性变化，但检测到化合物在沉默组织中的积聚，但在空载体对照中没有。

该化合物基于与通过化学还原获得的获得的标准品共洗脱被指定为。化学型最可能的解释是，这种MATE转运蛋白将从细胞质转运到液泡的位置。缺乏赛洛甘素转运会导致细胞质中赛洛甘素的积聚，其中活性醛将被还原为毒性较小的赛洛甘醇。

所有异源表达用于体外运输测定的尝试都没有成功。该基因簇已在其他单萜吲哚生物碱生产者和中观察到，表明它在生产严格糖胺的植物中是保守的。还观察到生物合成基因通过染色体环在3D空间中相互作用。

叶片细胞类型分辨率下的基因表达

原位杂交实验已经确定了参与双吲哚生物碱生物合成的38个已知生物合成基因亚群的表达特异性，其中初始步骤位于韧皮部相关实质细胞中，表皮中的下游酶和位于特异细胞中的晚期酶我们对13至14周龄的玫瑰梭菌叶进行了单细胞RNA测序并获得15437个细胞和19337个基因的基因表达谱。

使用修拉整合了三个独立的生物学重复23在三个重复中具有相似的聚类模式。使用拟南芥标记基因直系同源物分配细胞类型。使用先前研究的玫瑰梭菌生物合成基因推断两种细胞类型特异母细胞，这些基因显示细胞类型特异性表达1819。

在一项独立实验中，使用平台在单细胞水平上分析了1379个细胞的基因表达。尽管使用平台检测到的细胞类型较少，但两个不同平台检测到的前3000个可变基因的表达谱在两个不同平台检测到的细胞类型之间高度一致。

使用全组织或器官来源的基因表达数据集进行共表达分析，使单萜吲哚生物碱生物合成途径基因的发现成为可能。整个器官来源的表达丰度提供了对器官中所有细胞的表达估计。如果一个基因在罕见的细胞类型中表达，例如特异细胞，则共表达分析的能力充其量是有限的。

检查了跨细胞类型生物合成基因表达的数据，发现该途径在三种特定的叶细胞类型中明确表达。与组织特异性谱相比，细胞类型特异性表达谱的分辨率明显提高。先前通过原位杂交表征的7个生物合成基因的细胞类型特异性，表达模式证实了对单萜吲哚生物碱生物合成的细胞类型分辨率。

该途径的和环烯醚萜阶段在中表达，而该途径的生物碱段主要在表皮中表达，并且该途径的最后已知步骤仅在成毛细胞中表达。先前的工作表明，由大亚基和小亚基组成的异二聚体负责单萜吲哚生物碱生物合成中使用的香叶基焦磷酸盐。

结论

进行了基因共表达分析，产生了生物合成基因以及先前报道的转录因子的网络图。该网络自组织为三个主要模块，催化蛇纹石的形成，蛇纹石具有强烈的蓝色自发荧光，以前曾被用作特异母细胞的视觉标志物特异母细胞模块的回收证实了该共表达分析的稳健性。

在茉莉酸引发后，进而激活单萜吲哚生物碱生物合成基因是任何含有生物合成基因的模块的一部分表明响应JA的调节机制与控制细胞类型特异性表达的机制不同。在表皮模块内检测到，提示反应性以外的调节作用。共表达模块内所有基因的基因标识符。

叶片数据集与从先前建立的定位方法中获得的数据一致，并为基因发现提供了准确和高分辨率的数据。细胞类型分辨率表达模式产生了共表达网络，阐明和扩展了调控关系。

参考文献

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